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不是
葡萄干是怎么作成的?它是采收自一种没有种子的葡萄品种﹐浸入煮开的碱水五秒除去蜡质后﹐晒干而成。每一粒的葡萄干﹐都代表着一颗浓缩后的葡萄。天然的葡萄干﹐会保留晒干后的葡萄甜味﹐而不另添加砂糖﹑人工甘味剂或其它色素﹐可以把它当成一种健康的零食。
其实葡萄营养素的含量并不特出。但是葡萄干的口感佳﹐容易取食﹐又可不自觉的吃下相当于大量葡萄的营养﹐因此被视为不错的营养来源。葡萄干的主要成份是糖份与膳食纤维﹐并含少量蛋白质与维生素。矿物质则以钾的含量最丰富﹐因此也是「碱性食物」。钾与正常的心跳及肌肉收缩有关,并与钠合作控制体内的平衡,并协助稳定血压及正常的神经传导,如果饮食中钠多钾少,有可能使血压不稳。
有人喜欢一边看电视一边吃零食。这些零食的特性是高油﹑高盐﹑高糖及高热量﹐很伤身体。葡萄干高纤高钾的特性﹐可以供作日常生活与小朋友的健康零食﹐也可以加入甜点中为甜点的营养加分。不过﹐它也是高糖的食物。多吃﹐还是会不自觉地吃下一堆热量。因此还是不要一次吃得太多为宜。
碱基互补配对原则 the principle of complementary base pairing
在DNA分子结构中,由于碱基之间的氢键具有固定的数目和DNA两条链之间的距离保持不变,使得碱基配对必须遵循一定的规律,这就是Adenine(A,腺嘌呤)一定与Thymine(T,胸腺嘧啶)配对,Guanine(G,鸟嘌呤)一定与Cytosine(C,胞嘧啶)配对,反之亦然。碱基间的这种一一对应的关系叫做碱基互补配对原则。
腺嘌呤与胸腺嘧啶之间有两个氢键,鸟嘌呤与胞嘧啶之间有三个氢键,即A=T, G≡C
根据碱基互补配对的原则,一条链上的A一定等于互补链上的T;一条链上的G一定等于互补链上的C,反之如此。因此,可推知多条用于碱基计算的规律。
规律一:在一个双链DNA分子中,A=T、G=C。即:A+G=T+C或A+C=T+G。也就是说,嘌呤碱基总数等于嘧啶碱基总数,各占全部碱基总数的50%。
规律二:在双链DNA分子中,两个互补配对的碱基之和的比值与该DNA分子中每一单链中这一比值相等。(A1+A2+T1+T2)/(G1+G2+C1+C2)=(A1+T1)/(G1+C1)=(A2+T2)/(G2+C2)
规律三:DNA分子一条链中,两个不互补配对的碱基之和的比值等于另一互补链中这一比值的倒数,即DNA分子一条链中 的比值等于其互补链中这一比值的倒数。(A1+G1)/(T1+C1)=(T2+C2)/(A2+G2)
规律四:在双链DNA分子中,互补的两个碱基和占全部碱基的比值等于其中任何一条单链占该碱基比例的比值,且等于其转录形成的mRNA中该种比例的比值。即双链(A+T)%或(G+C)%=任意单链 (A+T)%或(G+C)%=mRNA中 (A+U)%或(G+C)%。
规律五:不同生物的DNA分子中,其互补配对的碱基之和的比值(A+T)/(G+C)不同,代表了每种生物DNA分子的特异性。
聚合酶链锁反应(Polymerase Chain Reaction)即聚合酶链式反应,简称PCR,是一种分子生物学技术,用于扩增特定的DNA片段。可看作生物体外的特殊DNA复制。
DNA聚合酶(DNA polymerase I)最早于1955年发现 ,而较具有实验价值及实用性的Klenow fragment of E. Coli 则是于70年代的初期由Dr. H. Klenow 所发现,但由于此酶不耐高温,高温能使之变性, 因此不符合使用高温变性的聚合酶链式反应。现今所使用的酶(简称 Taq polymerase), 则是于1976年从温泉中的细菌(Thermus aquaticus)分离出来的。它的特性就在于能耐高温,是一个很理想的酶,但它被广泛运用则于80年代之后。PCR最初的原始雏形概念是类似基因修复复制,它是于1971年由 Dr. Kjell Kleppe 提出。他发表了第一个单纯且短暂性基因复制(类似PCR前两个周期反应)的实验。而现今所发展出来的PCR则于1983由 Dr. Kary B. Mullis发展出的,Dr. Mullis当年服务于PE公司,因此PE公司在PCR界有着特殊的地位。Dr. Mullis 并于1985年与 Saiki 等人正式表了第一篇相关的论文。此后,PCR的运用一日千里,相关的论文发表质量可以说是令众多其它研究方法难望其项背。随后PCR技术在生物科研和临床应用中得以广泛应用,成为分子生物学研究的最重要技术。Mullis也因此获得了1993年诺贝尔化学奖。
[PCR原理]
DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解链成单链,在DNA聚合酶与启动子的参与下,根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子拷贝。在实验中发现,DNA在高温时也可以发生变性解链,当温度降低后又可以复性成为双链。因此,通过温度变化控制DNA的变性和复性,并设计引物做启动子,加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。
但是,DNA聚合酶在高温时会失活,因此,每次循环都得加入新的DNA聚合酶,不仅操作烦琐,而且价格昂贵,制约了PCR技术的应用和发展。
发现耐热DNA聚合同酶--Taq酶对于PCR的应用有里程碑的意义,该酶可以耐受90℃以上的高温而不失活,不需要每个循环加酶,使PCR技术变得非常简捷、同时也大大降低了成本,PCR技术得以大量应用,并逐步应用于临床。
[PCR步骤]
标准的PCR过程分为三步:
1.DNA变性(90℃-96℃):双链DNA模板在热作用下,氢键断裂,形成单链DNA
2.退火(25℃-65℃):系统温度降低,引物与DNA模板结合,形成局部双链。
3.延伸(70℃-75℃):在Taq酶(在72℃左右最佳的活性)的作用下,以dNTP为原料,从引物的5′端→3′端延伸,合成与模板互补的DNA链。
每一循环经过变性、退火和延伸,DNA含量既增加一倍。如图所示:
现在有些PCR因为扩增区很短,即使Taq酶活性不是最佳也能在很短的时间内复制完成,因此可以改为两步法,即退火和延伸同时在60℃-65℃间进行,以减少一次升降温过程,提高了反应速度。
[PCR检测]
PCR反应扩增出了高的拷贝数,下一步检测就成了关键。荧光素(溴乙锭)染色凝胶电泳是最最常用的检测手段。电泳法检测特异性是不太高的,因此引物两聚体等非特异性的杂交体很容易引起误判。但因为其简捷易行,成为了主流检测方法。近年来以荧光探针为代表的检测方法,有逐渐取代电泳法的趋势。
[PCR反应特点]
特异性强
PCR反应的特异性决定因素为:
①引物与模板DNA特异正确的结合;
②碱基互补配对原则;
③TaqDNA聚合酶合成反应的忠实性;
④靶基因的特异性与保守性。
其中引物与模板的正确结合是关键。引物与模板的结合及引物链的延伸是遵循碱基配对原则的。聚合酶合成反应的忠实性及Taq DNA聚合酶耐高温性,使反应中模板与引物的结合(复性)可以在较高的温度下进行,结合的特异性大大增加,被扩增的靶基因片段也就能保持很高的正确度。再通过选择特异性和保守性高的靶基因区,其特异性程度就更高。
灵敏度高
PCR产物的生成量是以指数方式增加的,能将皮克(pg=10- 12)量级的起始待测模板扩增到微克(ug=-6)水平。能从100万个细胞中检出一个靶细胞;在病毒的检测中,PCR的灵敏度可达3个RFU(空斑形成单位);在细菌学中最小检出率为3个细菌。
简便、快速
PCR反应用耐高温的Taq DNA聚合酶,一次性地将反应液加好后,即在DNA扩增液和水浴锅上进行变性-退火-延伸反应,一般在2~4 小时完成扩增反应。扩增产物一般用电泳分析,不一定要用同位素,无放射性污染、易推广。
对标本的纯度要求低
不需要分离病毒或细菌及培养细胞,DNA 粗制品及RNA均可作为扩增模板。可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等DNA扩增检测。
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